Ю.С. Кривошеин, Г.Ю. Ажицкий
ЭЛЕКТРОФОРЕТИЧЕСКОЕ ИССЛЕДОВАНИЕ В КОСМОСЕ
Электрофорез в биотехнологии, на земле, применяется для анализа сложных смесей биополимеров, например белков, а также для их высокоэффективной очистки. Для получения высокого разрешения разделение проводят в гелевых средах, что существенно суживает круг решаемых задач, особенно препаративных.
Теоретическими расчетами и экспериментальными данными, как за рубежом, так и в СССР, было показано преимущество электрофоретического разделения биообъектов в условиях микрогравитации по сравнению с земными, так как в невесомости резко уменьшаются факторы ухудшающие разделение зон биополимеров. Это обусловлено отсутствием теплоконвекционных потоков жидкости в электрофоретической колонке, что позволяет отказаться от гелевых сред и резко расширяет возможности жидкостного электрофореза, а также расширяет перечень объектов разделения, а именно появляется возможность фракционирования и очистки живых вирусов и бактерий.
В нашей стране эти работы были начаты группой исследователей кафедры биохимии (рук.Г.Ю.Ажицкий), под общим контролем академика Г.В.Троицкого, в 1979 г. совместно с НПО "Энергия" и "Ротор" и институтом вакцин и сывороток им.Пастера, г.Санкт-Петербург. Работы велись фактически в режиме полусекретности.
К этому времени были уже получены обнадеживающие результаты первых экспериментов по электрофорезу, проведенных на кораблях серии "Аполлон" и "Шатл" в США. Было показано, что космическое биотехнологическое производство может осуществлять выработку препаратов по качеству и количеству недостижимых земных условиях.
На развитие работ по электрофорезу в СССР, в условиях космического полета, был направлен эксперимент "Таврия" который впервые был выполнен на станции "Салют" с 12 по 24 августа 1982 г. Его результаты показали, что в условиях микрогравитации повышается разрешающая способность свободно- жидкостных электрофорических методов разделения биологических препаратов (сывороточный альбумин и гемоглобин) в 10-15 раз, также существенно возрастает производительность процесса. В ходе подготовки к этому эксперименту были решены сложные научные и инженерные задачи, например, отвод газов в невесомости с электродов, или разработка новых буферных систем высокой емкости, но низкой электропроводности.
Первые эксперименты были настолько удачными, что это позволило перейти к моделированию в невесомости электрофоретических установок для препаративного фракционирования биообъектов. В качестве основного объекта использовался геммаглютинин вируса гриппа (ГА), который необходимо было очистить от примесного белка овальбумина. В случае полной (близко к 100 %) очистки ГА, его можно было бы использовать как высокоэффективную молекулярную вакцину против гриппа.
Предварительно подчищенный на земле, ГА был подвергнут очистке в невесомости на модифицированной установке "Таврия". Этот эксперимент был проведен в 1983г. на орбитальном комплексе "Салют-Союз" космонавтом А.Александровым в 1984 г., во время работы экспедиции посещения на борт орбитальной станции "Салют-7". Эти эксперименты затем были продолжены в 1985 г. на борту этой же станции космонавтами А.Серебровым и С.Савицкой.
Оптимизация режимов электрофореза привела к созданию установки нового поколения - ЭФУ - Робот, которая прошла успешные испытания на корабле "Союз Т-14". Работы выполнялись космонавтом В.Васютиным. В 1985г. на ней были получены уникальные по чистоте препараты ГА не содержащие примеси овальбумина. Таким образом, 7-летняя программа "Таврия" была успешно выполнена.
С 1985г. общее руководство работ по электрофорезу в невесомости осуществлялось проф.Ю.С.Кривошеиным, что было связано с интересом к очистке микробиологических продуцентов. Разрабатывается и новая аппаратура. В дальнейших экспериментах уже используются автоматические установки "Светлана" и "Ручей". Формируется новая программа "Микрофор".
Согласно техническому заданию по этой программе в 1985-1990гг. предусматривалась дальнейшая разработка электрофоретических методов очистки биообъектов, предназначенных для промышленной биотехнологии в условиях изделия. Эта работа была органическим продолжением ранее выполненных исследований по программе "Таврия". Кроме КМИ, в ней предусматривалось участие ведущих научных учреждений страны: ИБХ им.Шемякина, ЛенНИИВС, НПО Биотехнология и др.
Первые эксперименты начаты на установке "Светлана" и "ЭФУ-Робот". Были получены интересные результаты в штатных условиях с разделением модельных белков и клеток, а также удалось получить достаточно большие количества чистого ГА и выделить высокоактивную фракцию спор грибкового продуцента антибиотика тилозина.
Можно с уверенностью сказать, что установки: "Таврия", "Светлана" и "Робот" сыграли важную роль на начальном этапе развития направления по использованию электрофореза в космосе и позволили решить ряд теоретических и практических задач для создания электрофоретической аппаратуры следующего поколения, а именно: свободно - поточные установки, первой из которых у нас была "ЭФУ - Ручей".
Эта установка была представлена промышленностью в наше распоряжение в июне 1987 г., и уже с июля на ней начаты эксперименты. Электрофоретическая камера этого аппарата представлена плоской щелью между стеклами, в которой непрерывно протекает буферный раствор с очищаемым образцом. Перпендикулярно потоку жидкости накладывается электрическое поле, которое и позволяет удалить примеси. На земле эти аппараты имеют низкую производительность из-за невозможности сделать щель между стеклами шириной более 0,1 мм. В невесомости это препятствие отсутствует. В аппарате "Ручей" щель была размером 3 мм. Всего на этой установке в условиях орбитального космического полета было проведено 16 экспериментов. В качестве биообъектов были использованы модельные смеси окрашенных белков, смесь куриных и бараньих эритроцитов, и основное количество экспериментов посвящено очистке от примесей препаратов генно- инженерного альфа 2-интерферона.
В результате этих экспериментов была получена огромная информация о работе "ЭФУ - Ручей" в условиях микрогравитации. Было показано, что возможно проведение электрофореза биообъектов в невесомости на свободно- поточных установках с шириной щели 3 мм. Показано, что отсутствуют седиментационные и конвективные явления, препятствующие электрофорезу.
Удалось значительно увеличить количество препарата, подвергаемого очистке. При очистке генно-инженерного альфа 2-интерферона человека показана принципиальная возможность его полной очистки от примесей при высокой производительности процесса.
Однако следует отметить, что конструктивная особенность установки "Ручей"- ограниченное число выходов, несовершенство систем ввода и вывода буферных растворов и образца, были ограничивающими факторами для достижения более оптимального разделения биообъектов.
Большая работа была проведена нами по разработке и адаптированию к электрофоретическим установкам и биообъектам буферных систем. Были созданы буферные системы для зонального электрофореза, изоэлектрофокусирования и изотахофореза, где учитывались рН, вязкость, электропроводность от соотношения компонентов буферной системы, их влияние на подвижность целевого продукта и примесей, токсическое действие на биообъект и др. Наиболее удачной для этих целей оказалась борат -полиольная система.
Параллельно отработке космических экспериментов, постоянно совершенствовалась экспериментальная база в Крымском медицинском институте. Получили развитие новые методы электрофореза, хироматографии, тестирования, методы, позволяющие оценить иммунные свойства антигена, микроаналитические методы и т.п. Все это позволило создать стройно работающую систему подготовки сложных биотехнологических экспериментов в космосе и высококвалифицированных научных кадров.
Следующим этапом, который проводился уже на станции Мир, на установке 3-го поколения - "Поток" были эксперименты по очистке энергоемкого белка - люциферазы - и использование его для кристаллизации в космосе на установке "Бокрист". Эти эксперименты были успешно завершены, получены и доставлены на землю крупные кристаллы люциферазы, которые были переданы Академии наук СССР для рентгеноструктурного изучения.
Удачный творческий контакт нашего коллектива с коллективом кафедры промышленной биотехнологии МХТИ им.Менделеева позволил в короткое время подготовить и провести на станции Мир уникальные эксперименты по культивированию в специально созданном бортовом биореакторе, генно- инженерных штаммов микроорганизмов.
Выполненные многолетние работы позволили сделать заключение о целесообразности дальнейшего развития биотехнологических исследований в условиях микрогравитации и необходимости создания биотехнологического комплекса с замкнутой системой.
К сожалению, распад СССР привел к перерыву в этих исследованиях, особенно той части, которая проводилась на Украине, но в целом, по данным литературы, это направление успешно развивается как в США, так и в России. Это позволяет надеяться на возобновление этих работ и на Украине. В частности, национальным космическим агентством Украины объявлен конкурс на финансирование лучших проектов по экспериментам в невесомости на международной космической станции "Альфа". Коллектив ученых КрМУ, и прежде всего авторы этой статьи приняли участие в указанном конкурсе, и есть определенные надежды, что работы в этом направлении будут продолжены.
* * *